微生物實驗室檢測方法的驗證和確認

制品微生物檢驗方法主要分兩種類型，定性試驗和定量試驗。定性試驗就是測定樣品中是否存在活的微生物，如無菌檢查及控制菌檢查。定量試驗就是測定樣品中存在的微生物數量，如微生物計數試驗。

制品微生物檢驗方法是經過驗證的，只需要按照要求進行方法適用性測試。

隨著微生物學的技術發展，一些領域引人了一些新的微生物檢驗技術，如脂肪酸測定技術、核酸擴增技術、基因指紋分析技術等。這些方法與傳統檢查方法比較，簡便快速或具有實時或近實時監控的潛力。

（1）微生物定性替代檢驗方法的驗證

①專屬性    微生物定性檢驗的專屬性是檢測樣品中可能存在的特定微生物種類的能力。當替代方法以微生物生長作為判斷微生物是否存在時，其專屬性驗證時應確認所用培養基的促生長試驗，還應考慮樣品的存在對檢驗結果的影響。當替代方法不是以微生物生長作為判斷指標時，其專屬性驗證應確認檢測系統中的外來成分不得干擾試驗而影響結果，如確認樣品的存在不會對檢驗結果造成影響。采用替代方法進行控制菌的檢驗，還應選擇與控制菌具有類似特性的菌株作為驗證對象。

②檢測限    微生物定性檢驗的檢測限是指在替代方法設定的檢驗條件下，樣品中能被檢出的微生物的特別小數量。由于微生物所具有的特殊性質，檢測限是指在稀釋或培養之前初始樣品所含有的微生物數量,而不是指檢驗過程中某一環節的供試液中所含有的微生物數量。

檢測限確定的方法是在樣品中接種較低濃度的試驗菌（每單位不超過5cfu)，然后分別采用藥典方法和替代方法對該試驗菌進行檢驗，以檢出與否來比較兩種方法的差異。試驗菌接種量須根據試驗而定，以接種后采用檢測方法50%的樣品可檢出該試驗菌為宜。檢測限驗證至少應重復進行5次。對于同一種試驗菌可采用卡方檢驗來評價兩種方法的檢測限是否存在差異。

③重現性    重現性可視為微生物檢驗方法在檢驗結果上抵抗操作和環境變化的能力。方法使用者應優先測定該驗證參數。在樣品中接種一定數量的試驗菌（接種量應在檢測限以上)，采用替代方法，分別由不同人員，在不同時間，使用不同的試劑（或儀器)進行檢驗，采用卡方檢驗(χ²）來評價兩種方法的重現性是否存在差異。驗證過程中，應關注樣品的一致性。

④耐用性    若替代方法檢驗條件較為苛刻，則應在方法中加以說明，應單獨對替代方法的耐用性進行評價，以便了解方法的關鍵操作點。

（2）樣品中微生物定量檢驗方法的驗證

①準確度   微生物定量檢驗的準確度是指替代方法的檢驗結果與方法檢驗結果一致的程度，通常用微生物的回收率（%）表示。

準確度驗證的方法:制備試驗菌的菌懸液，菌懸液的濃度應選擇為能夠準確計數的較高濃度，然后系列稀釋至較低濃度（如小于10cfu/mL)。例如，菌落計數平皿法的替代方法，在制備高濃度菌懸液時其濃度是10³cfu/mL，系列稀釋至10° cfu/mL。每個試驗菌應至少選擇5個菌濃度進行準確度確認，替代方法的檢驗結果不得少于方法檢驗結果的70%，也可以采用合適的統計學方法表明替代方法的回收率至少與方法一致。

②精密度    精密度驗證的方法是:制備試驗菌的菌懸液，菌懸液的濃度應選擇為能夠準確讀數的較高濃度，然后系列稀釋至較低濃度（如小于10cfu/mL)。每個試驗菌選擇其中至少5個濃度的菌懸液進行檢驗。每一個濃度至少應進行10次重復檢驗，以便能夠采用統計分析方法得到標準偏差或相對標準偏差。

③專屬性    專屬性驗證應證明當樣品中存在一定數量的試驗菌時,通過平皿法檢驗,能夠檢出試驗菌，而樣品的存在不會對結果造成影響。專屬性驗證時，應能夠設計出可能使替代方法出現假陽性的實驗模型來挑戰替代方法。當替代方法不依賴微生物生長出菌落或出現混濁就可以定量時（如不需要增菌或在1～50cfn節圍內就可直接測定的的定量方法)，以上驗證方式就顯得更為重要。中凈環球凈化可提供潔凈廠房、GMP車間、生物實驗室的咨詢、規劃、設計、施工、安裝改造等配套服務。

④定量限    定量限驗證的方法是:在檢驗范圍的低限制備5份不同含菌濃度的菌懸液，每份菌懸液分別用藥典方法和替代方法進行不少于5次檢驗，采用統計方法比較替代方法的檢驗結果與藥典方法結果的差異，從而評價替代方法的定量限。

⑤線性和范圍    線性驗證時須覆蓋能夠準確測定的所有濃度范圍。每株試驗菌應選擇至少5個濃度，每個濃度至少測定5次。根據以上實驗數據，以檢驗結果為因變量，以樣品中微生物的預期數量為自變量進行線性回歸分析，計算相關系數r。替代方法的相關系數不得低于0.95。

微生物定量檢驗的范圍是指能夠達到一定的準確度、精密度和線性，檢驗方法適用的高低限濃度或數量的區間。

⑥重現性    在樣品中接種一定數量的試驗菌（接種量應在定量限以上)，采用藥典方法和替代方法，分別由不同人員，在不同時間，使用不同的試劑（或儀器)進行檢驗，對檢驗結果進行統計分析，以相對標準偏差（RSD)來評價兩種方法的重現性差異。

⑦耐用性    替代方法與藥典方法的耐用性比較不是必需的，但應單獨對替代方法的耐用性進行評價,以便了解方法的關鍵操作點。

（3）檢驗方法活用性

使用藥典方法進行產品無菌檢查時，應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產品的無菌檢查。若檢驗程序或產品發生變化可能影響檢驗結果時，應重新進行方法適用性試驗。

薄膜過濾法是取每種培養基規定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾。另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。置規定溫度下培養，培養時間不得超過5天，其他各試驗菌同法操作。

直接接種法是取符合直接接種法培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養基6管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接種法培養基用量要求的胰酪大豆胨液體培養基6管，分別接入小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培養基規定的供試品接種量，另1管作為對照，置規定的溫度培養,培養時間不得超過5天。

結果與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計。如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，應消除供試品的抑菌作用,并重新進行方法適用性試驗。

（4）非無菌產品微生物限度檢查

計數方法驗證的原理主要是確認樣品有無抑菌性，即確認檢驗樣品中的微生物能否在此培養基中正常生長。通常方法是在檢驗樣品中加入代表類型的菌種（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉，加菌量應不大于100cfu)，各試驗菌應逐一進行驗證試驗。如果供試品對微生物生長具有抑制作用則需要采用適當方法消除抑制作用。

（5）控制菌檢查方法適用性

控制菌檢查法系用于在規定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物，應根據各品種項下微生物限度標準中規定檢查的控制菌選擇相應試驗菌株。

按控制菌檢查法取規定量供試液及不大于100cfu的試驗菌接入規定的培養基中;采用薄膜過濾法時,取規定量供試液，過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗菌，過濾后，注入規定的培養基或取出濾膜接入規定的培養基中。依相應的控制菌檢查方法，在規定的溫度和最短時間下培養，應能檢出所加試驗菌相應的反應特征。如果上述試驗若檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進行供試品檢查;若未檢出試驗菌，應消除供試品的抑菌活性并重新進行方法適用性試驗。

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